斑马鱼磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒说明书
发表时间：2026-03-11产品名称： 斑马鱼磷酸化组蛋白H2AX（γH2AX）ELISA检测试剂盒
检测方法： 双抗体夹心酶联免疫吸附法
保存： 2-8℃保存，有效期详见外包装。标准品、生物素化抗体、辣根过氧化物酶标记亲和素需按说明书要求分装保存于-20℃。
规格： 96T
一、检测原理
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗斑马鱼γH2AX抗体包被微孔板，制成固相载体。向包被的微孔中依次加入样品或标准品、生物素标记的抗斑马鱼γH2AX抗体，再与辣根过氧化物酶标记的亲和素结合。经过彻底洗涤后，加入底物TMB进行显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的斑马鱼γH2AX浓度呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度，通过标准曲线计算样品中斑马鱼γH2AX的浓度。
二、样品收集、处理及保存方法
组织匀浆：取适量斑马鱼组织（如胚胎、肝脏、脑等），用预冷的PBS（0.01M，pH 7.4）冲洗，除去多余水分。将组织剪碎，加入一定量的PBS（如1:9重量体积比），用匀浆器在冰上充分匀浆。随后，2-8℃下5000×g离心5-10分钟，取上清液立即检测或分装于-20℃/-80℃保存，避免反复冻融。
细胞培养上清液：收集斑马鱼细胞培养液，2-8℃下1000×g离心20分钟，取上清液立即检测或分装保存。
其他生物体液：如血液、血清、血浆等，需按常规方法处理后检测。血浆样本需用EDTA或柠檬酸钠抗凝，不建议使用肝素。
三、试剂盒组成
四、操作步骤
准备：
从冰箱中取出试剂盒，室温平衡20-30分钟。
用蒸馏水将20×浓缩洗涤液稀释至1×工作液备用。
用标准品稀释液梯度稀释标准品。注意：此步骤至关重要，请严格按说明书要求的浓度（例如：0, 10, 20, 50, 100, 200 pg/mL）和体积进行操作。
将生物素化抗体、酶结合物工作液按需稀释（如果需要）。
加样：
设置标准品孔、待测样品孔和空白孔。空白孔加样品稀释液。
标准品孔：加入不同浓度的标准品100μL。
待测样品孔：加入适当稀释的待测样品100μL。轻轻晃动混匀。
温育：
用封板膜封板，置于37℃温箱或水浴锅中，温育60-90分钟（具体时间见说明书）。
加抗体：
弃去液体，甩干，无需洗涤。
每孔加入生物素化抗体工作液100μL，封板膜封板，37℃温育30-60分钟。
洗涤：
弃去孔内液体，甩干，用洗涤液加满每孔，静置30秒后弃去，在厚叠吸水纸上拍干。重复此步骤3-5次。
加酶结合物：
每孔加入辣根过氧化物酶标记的亲和素工作液100μL，封板膜封板，37℃温育30分钟。
洗涤：
重复步骤5的洗涤过程5次，确保洗涤彻底。
显色：
每孔依次加入底物溶液A、B各50μL（或直接加入已混合的TMB 100μL），37℃避光显色10-20分钟。注意观察：标准品孔出现明显的蓝色梯度时即可终止。
终止与测定：
每孔加入终止液50μL，此时蓝色立即转为黄色。
以空白孔调零，在加入终止液后15分钟内，用酶标仪在450nm波长下测量各孔的吸光度值。
五、结果计算
以标准品的浓度为横坐标，对应的OD值为纵坐标，绘制标准曲线（推荐使用四参数或二次多项式拟合）。
将样品的OD值代入标准曲线方程，计算出样品浓度。
如果样品在检测前进行了稀释，计算出的浓度需乘以对应的稀释倍数。
六、注意事项
安全：试剂盒中的终止液为酸性溶液，避免与皮肤、黏膜接触。
准确性：请在有效期内使用试剂。不同批号的试剂组分请勿混用。
加样：加样时尽量不触及孔壁，加样时间尽量短，保持实验的一致性。
温育：为获得最佳结果，请确保温育时微孔板完全被水浴锅或温箱覆盖，以保证温度均一。
洗涤：洗涤不彻底是导致结果不准确的关键因素，必须确保充分洗涤和拍干。
显色：TMB对光和氧敏感，请避光保存，并在规定时间内完成检测。显色时间可根据标准品孔的颜色深浅适当调整。
样品：避免使用严重溶血、高血脂或已被污染的样品。组织样本建议设置阳性对照（如经辐照或药物处理的样本）。
七、灵敏度、精密度与特异性
最低检测限：通常 < 1.0 pg/mL。
回收率：样本中添加标准品的回收率应在80%-120%范围内。
批内/批间精密度：板内、板间变异系数（CV）均应小于10%。
特异性：本试剂盒可特异性检测天然和重组的斑马鱼γH2AX蛋白，与人、大鼠、小鼠等物种的γH2AX交叉反应性<1%。
八、应用
本试剂盒用于定量检测斑马鱼组织、细胞裂解液或其他相关生物液体中内源性γH2AX的浓度。γH2AX是DNA双链断裂的标志物，广泛应用于评估斑马鱼在遗传毒理学、放射生物学、环境毒理学、抗癌药物筛选等领域中的DNA损伤与修复响应。
再次提醒，本说明书为通用模板，操作前请务必阅读并遵循您所购试剂盒附带的实际说明书。
